TÇCD 2013 31st Annual Congress of Turkish Pediatric Surgical Association

• Background

Even though our knowledge about necrotizing enterocolitis has been growing, still remains to be limited which prevents improving management strategies. Excessive inflammatory response and impaired restitution are thought to be the main mechanisms beneath necrotizing enterocolitis. This study focused on the effect of resveratrol on impaired restitution and excessive inflammatory response by constituting an experimental  necrotizing enterocolitis cell culture model.

• Methods

IEC-6 culture and application of lipopolysaccharide (LPS, 50μg/ml) or cytokine mixture (TNF-a:10 ng/mL, IFN-γ:1000 IU/mL, IL-1β: 1ng/mL) was used to constitute an experimental necrotizing enterocolitis model. IEC-6 culture cells were wounded, and then after pretreatment with resveratrol at different dosages, either lipopolysaccharide (LPS) or cytokine mixture were applied. To evaluate migration images were taken at 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 and 24 h after application and analysed. Then using the same model inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2) levels, focal adhesion kinase (FAK), phosporilated FAK (pFAK) levels were assessed with western blot analyses.

• Main Results

Mean percent of the denuded area that was plated by cells at the 24th hour were as follows: 87% for control group,  85% for vehicle group, 53% for LPS group, 35% for cytokine mixture group. The treatment with resveratrol at doses of 0.5, 1 and 5 µM/L before LPS application resulted in repair of 84%, 86% and 75% denuded areas respectively. Likewise, treatment with resveratrol at doses of 0.5, 1 and 5 µM/L before cytokine mixture application resulted in 85%, 81% and 77% respectively. iNOS, COX-2 and pFAK levels were found to be increased with both LPS and cytokine mixture and levels near control groups were found with resveratrol pretreatment. FAK levels were within similar ranges in all groups.

• Conclusion

Resveratrol, was found to suppress excessive inflammatory response and help preservation of mucosal integrity by inhibiting FAK phosphorilation in experimental necrotizing enterocolitis cell culture model.

• Giriş

Nekrotizan enterokolitin etyopatogenezi konusunda çok sayıda çalışma yapılmış olmakla birlikte bilgilerimiz birçok açıdan sınırlıdır ve bu sebeple halen tam etkin tedavi stratejileri geliştirilememektedir. Nekrotizan enterokolitte temel mekanizmanın artmış inflamasyon cevabı ve sitokinler etkisiyle bozulmuş restitüsyon olduğu düşünülmektedir. Bu çalışmanın amacı hücre kültürü ortamında deneysel nekrotizan enterokolit modeli oluşturarak resveratrolün artmış enflamasyon ve restitüsyon üzerine etkilerini gözlemlemektir.

• Gereç-Yöntem

IEC-6 kültür hücreleri çoğaltıldıktan sonra deneysel yara ve resveratrol uygulanan/uygulanmayan şeklinde ikişer grup oluşturulmuştur. Ardından hücreler lipopolisakkarit (LPS, 50μg/ml)  ya da sitokin karışımı (TNF-a:10 ng/mL, IFN-γ:1000 IU/mL, IL-1β: 1ng/mL) ile muamele edilerek 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 ve 24. saatte yara fotoğraflanmış, alan ölçümler yapılmış, böylece yara iyileşmesi üzerine etkileri değerlendirilmiştir. Ardından aynı koşullar tekrar oluşturularak indüklenebilir nitrik oksit sentetaz (iNOS), siklooksijenaz-2 (COX-2), fokal adhezyon kinaz (FAK)  ve fosforile FAK (pFAK) enzim düzeyleri üzerine etkileri western blot yöntemiyle gözlenmiştir.

• Bulgular

Oluşturulmuş yaranın 24. saatte kapanma yüzdeleri kontrol grubu için %87, çözücü için %85, LPS için %53, sitokin karışımı için ise %35'tir. Benzer şekilde resveratrolün 0,5-1-5 µM/L şeklinde 3 farklı dozda uygulanmasının ardından LPS muamelesinde sırasıyla %84, %86 ve %76; sitokin muamelesinde ise %85, %81, %77 olarak saptanmıştır. Western blot deneylerinde LPS ve sitokin  uygulanmasının iNOS, COX-2, pFAK enzim düzeylerini artırdığı, resveratrol uygulanmasının ise hem LPS hem sitokinin etkilerini engellediği gözlenmiştir. FAK düzeylerinde ise herhangi bir deney grubunda belirgin değişim gözlenmemiştir.

• Sonuç

Deneysel nekrotizan enterokolit hücre kültürü modelinde resveratrolün hem inflamasyon yanıtını baskılayarak, hem de FAK fosforilasyonunu baskılamak yoluyla restitüsyonu düzelterek etkin olduğu gösterilmiştir.